Nature Medicine 免疫原性机制深度研究

Nature Medicine免疫原性机制深度研究:单一T细胞表位引起的严重中和抗体

文章转载自公众号  佰傲谷BioValley  作者 Eastwood

 

近日,瑞士提契诺大学与赛诺菲研发人员等在最新一期的《Nature Medicine》上发表了重要研究成果:Natalizumab单一T细胞表位促使多发性硬化症患者产生严重的中和抗体。文章的研究发现以严密充分的证据再次证实,T细胞表位是引起B细胞反应(此文中同时重点研究了中和性抗体)的主要原因,深化了对于免疫原性发生机制的认识。

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Natalizumab:6%中和抗体发生率

Natalizumab是一种靶向α4整合素的IgG4型抗体,最早由Elan公司开发,后授权给Biogen公司。2004年获得FDA批准上市,商品名为Tysabri,用于治疗多发性硬化症,2018年销售额18.6亿美元。根据临床数据,使用Natalizumab的患者有6%会产生中和抗体,导致治疗无法继续。为探究ADA以及中和性ADA产生机制,研究人员选取2名使用Natalizumab的患者,对其B细胞、T细胞响应进行了深入研究。

 

研究人员选取了2名产生强中和性抗体的多发性硬化症患者,分离了特异性结合Natalizumab的记忆B细胞、记忆T细胞。从A、B两位患者分离的B细胞上清中分别获得30个、10个单抗。A患者的单抗与natalizumab的亲和力更高,平均6.1pM,B患者为2.3nM。A患者中60%(18/30)的单抗为中和性抗体,即对Natalizumab结合α4整合素的IC90小于1000ng/ml;B患者则未见中和性抗体,可能与分离的单抗数目少有关

附表 2名患者分离的单抗

患者

单抗数

亲和力

中和性抗体比例

A

30

1-6790pM,平均6.1pM

60%(18/30)

B

10

0.4-22.7nM,平均2.3nM

0

 

研究人员构建了Natalizumab的64个突变体(6个CDR的替换突变组合),来研究A、B患者这些单抗识别Natalizumab的哪些CDR区。结果发现Natalizumab诱导产生的抗药抗体识别多个表位,并且聚焦于重链的CDR区。同时也发现,BAb(结合抗体,非中和抗体)相比NAb,VDJ的体细胞突变程度更低一些。


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中和抗体与非中和抗体的区别:表位不同、亲和力不同还是结合解离曲线性质有差异?

从上述Natalizumab CDR替换突变来看,BAb与NAb没有呈现出不同的集中倾向,提示两者并非是表位不同。从结合解离的动力学曲线来看,BAb与NAb则呈现出完全不同的性质:两者的结合常数Ka相当,但解离常数Kd则NAb明显更低,说明中和抗体NAb与Natalizumab结合后解离明显更慢。

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以中和抗体NAA84和结合抗体NAA32为代表,两者与Natalizumab的结合解离曲线如下。


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体细胞突变对于中和抗体的产生至关重要

对于体细胞突变的作用,研究人员将单抗亲和力(EC50)与中和效应(IC90)与未经体细胞突变的UCA进行比较,发现中和抗体NAb相对于非中和抗体BAb,其UCA已经具有很高的亲和力,但需要经过体细胞突变,才能获得完全的中和效应。证明体细胞突变对于中和抗体的产生具有至关重要的意义。

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接下来研究人员进行了结构生物学分析,分别获得了NAA84-NZM复合物和NAA32-NZM复合物的晶体结构。NAA84、NAA32分别识别NZM(Natalizumab)的22个和18个氨基酸,且其中14个氨基酸重合(13个与α4整合素的结合位点重合)。从结合面来看,NAA84与NZM结合的面积为617A2,NAA32与NZM结合的面积为757A2,但NAA84与NZM的结合更紧密。结构信息说明中和抗体与非中和抗体的主要差异不应是表位差异,而是结合强度/契合度的差异。

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T细胞表位诱导中和抗体的产生

从理论上来说,体细胞突变是由CD4 T细胞识别NZM idiotype的非自身抗原而驱动的。为了验证这一假设,研究人员分离了NZM特异性的T细胞,A患者获得了12个克隆,B患者获得了54个克隆。

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TCR-Vβ基因测序显示A、B分别有5个和至少7个基因型,惊人的结果是几乎所有这些T细胞都识别NZM轻链FR2和CDR2重合的2段多肽:GKAPRLLIHYTSALQPGI,作为为其命名为NZM-LCFR2-CDR2。值得注意的是,对NZM-LCFR2-CDR2的识别,A患者限定在HLA-DRB1*14/16,B患者限定在DRB1*07/07。上述结果说明,单一T细胞表位NZM-LCFR2-CDR2足以导致针对NAM idiotype产生很强的多克隆B细胞反应。


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接下来,研究人员用NZM刺激NZM特异性B细胞,利用质谱分析MHC-II结合的多肽,发现三组多肽。其中两组位于FR3、FR4-CH1,与人germline一致,理论上不会产生引起免疫反应。惊奇的是,第三组位于FR2-CDR2,TPGKAPRLLIHYTSALQPGIPSR,涵盖了前述的NZM-LCFR2-CDR2。同时,研究人员用软件对NZM轻链、重链完整序列以15mer多肽来预测其与不同MHC-II基因型的结合,发现NZM-LCFR2-CDR2的免疫原性具有更广泛的HLA基因背景,即可能对多种MHC-II基因型起作用。总之,这些证据说明NZM-LCFR2-CDR2是NZM唯一的T细胞表位,并能导致产生抗药抗体乃至中和抗体。

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去除Natalizumab免疫原性的尝试

综合前述的发现,研究人员开始尝试去除NZM的免疫原性。具体做法是对NZM-LCFR2-CDR2中不参与α4整合素结合的氨基酸,进行突变以去除免疫原性,同时保证构象尽量不影响α4整合素的结合。


研究人员构建了5个NZM突变体,序列如下图,其中第五个突变体为对应的Germline序列。结果var1、var3保持了抗原亲和力,var2、var4则部分失去康源亲和力,var5彻底失去抗原亲和力。效果非常明显地,5个突变体均失去NZM-LCFR2-CDR2特异性T细胞的能力。软件分析发现,var1、var3对其他MHC-II基因型的亲和力也明显下降。这说明,去免疫原性的NZM有进行体内实验的价值。

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总结

T-B细胞相互作用,对于B细胞活化产生抗体的机制已经属于共识。学术界和工业届也普遍以T细胞表位改造作为去除治疗性蛋白药物免疫原性的主要手段。一般是结合MHC-II结合、基于PBMC的激活以分析和验证T细胞表位。本文通过大量充分、有效的工作,证实了T细胞表位通过促进体细胞突变,产生亲和力更强的抗药抗体,乃至于进一步突变减小抗药抗体与抗体药物的解离常数,有效阻止抗体与抗原的结合即产生中和抗体的机制。

 

此外,Natalizumab作为人源化抗体,FR区和恒定区已经不存在T细胞表位。而临床上存在的小比例中和抗体患者,说明抗体存在较少乃至单一的T细胞表位。巧妙的选择,以及完备的实验方法,第一次详尽、完美的论证了T细胞表位导致ADA和中和性ADA的机制。