纳米抗体的发现及结构特点

摘要

纳米抗体是在骆驼科及鲨鱼科动物血清中大量存在的一种天然抗体,与常规单克隆抗体相比,纳米抗体缺失轻链,其重链可变区VHH的CDR3区较长,是目前已知的可结合抗原的最小单位。特殊的结构特征和性质赋予了其一些其它常规抗体或抗体片段所不具有的特性。本文讲从纳米抗体的发现,结构特点,生化特性及药物研发现状四个方面做一简要概述。

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纳米抗体的发现

近年来,随着抗体药物不断应用于更多治疗领域,抗体药物的治疗机理变得更为复杂,同时抗体药物的结构也变得更为多样化。纳米抗体(nanobodies,Nbs)因具有较小的相对分子质量,其独特的分子结构使其适用于疾病诊断治疗等诸多领域,当前得到了广泛的关注。纳米抗体的发现是在上世纪80年代,比利时布鲁塞尔自由大学的免疫学教授Hamers遇到了两个大学生向他抱怨学校安排的实验课程结果都是已知的,没有挑战性。于是Hamers教授将冰箱中剩余的半升用于研究昏睡病的骆驼血让学生Muyldermans等人尝试从中提纯骆驼的抗体。Muyldermans等人惊奇地发现,从骆驼血液中提纯的抗体中有一部分不属于所有脊椎动物的标准类型,而是一种完全新型的、更简单的变种抗体,这样的结果让所有人都很疑惑。Hamers立刻成立了研究小组对这种抗体进行专门研究,至此,骆驼抗体就从一个学生的实验迅速演变为Hamers和同事研究的主要项目。1993年,Hamers等首次在《自然》杂志中报道,在骆驼科及鲨鱼科动物血清中大量存在一种天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody,HcAb)。与常规单克隆抗体相比,除了缺少轻链外,其重链可变区与铰链区之间没有CH1区,只含有一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区(图1)。重链抗体的VHH片段与常规抗体的VH特征不同,但单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性,是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。结构解析结果表明:VHH晶体宽为2.5nm,长4.8nm,分子量只有约15KDa,因此也被称作纳米抗体(Nanobody)。

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图1 不同形式抗体示意图

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纳米抗体的结构特点

与常规单克隆抗体的VH折叠结构相似,纳米抗体的晶体和水溶性结构两个β片层组成支架。VHH的CDR3区较长,人和小鼠抗体VH的CDR3区平均长度为9-12个氨基酸,VHH的CDR3区为16-18个氨基酸。可变区的扩大能够形成更丰富的抗原结合构象,在一定程度上弥补了轻链缺失导致结合力下降的不足,从而使得纳米抗体本身具有较强的抗原结合能力。纳米抗体的CDR3区可形成一个特殊的凸环,凸环大部分折叠在FR2上,这里疏水残基受到保护,可避免与外界水环境接触。凸环中的半胱氨酸与CDR1(或FR2)区的半胱氨酸形成二硫键从而使其结构稳定。该凸环结构能够结合酶的裂隙或是凹穴,因此能够很好的成为酶的抑制剂、受体的激动剂或拮抗剂。

在常规单克隆抗体VH的FR2区,有四个氨基酸参与了与VL的相互作用,这四个氨基酸分别为V37、G44、L45、W47。而在纳米抗体VHH中,这四个氨基酸发生了突变,分别为F(Y)37、E44、R45、G47。这四个位点的变化不但使VHH保持了较好的特异性和亲和性,还使其具有高亲水性,从而能够保持稳定的结构(如图2所示)。

纳米抗体VHH基因由VH家族的亚族III进化而来,其丰富的基因序列多样性使得重链抗体可形成大量不同结构形式的凸环。人类VH3与骆驼VHH胚系基因具有高度的同源性,因此只需对VHH基因进行较少的改变即可实现抗体人源化,通过基因工程技术获得高亲和力、高特异性、高稳定性的纳米抗体。

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图2 VH和VHH 比较
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纳米抗体的生化特性

(1)免疫原性弱。免疫原性与分子量及化学结构等有关,分子量越小免疫原性越小。由于纳米抗体的分子量只有常规抗体的1/10,只有一个结构域,因此刺激机体形成特异性抗体或是引起体液和细胞免疫应答机率大大降低。同时,纳米抗体无Fc段,避免了Fc引起的补体反应,对人体免疫原性很低,与人的生物相容性较好但也有研究表明纳米抗体作为药物长期反复使用会增加免疫原性,影响治疗。无论如何,相比于传统抗体,纳米抗体在免疫原性方面表现的更弱。

(2)可溶性高、耐受性强。纳米抗体的FR2中四个位点的突变,使自身的溶解性增加,成药性更好。纳米抗体内部的二硫键使其抗热性和耐酸碱能力变得极强。常规单克隆抗体稳定性差,容易出现聚集现象,并发生不可逆的热聚合。而纳米抗体在高温环境中长期放置仍然具有生物活性,并且在强变性剂条件下也表现出较高的耐受性。

(3)组织渗透性强。仅有15kD的纳米抗体能够穿透血脑屏障,为大脑中疾病的研究及治疗提供新的方法。纳米抗体能够很容易从肾小球滤过,导致其很快从血清中被清除,半衰期变短。高渗透性的纳米抗体可进入致密的组织,而多余未结合的纳米抗体很快被清除,这有利于疾病的诊断。此外,纳米抗体也适合作为胞内抗体靶向胞内乃至核内蛋白。一种特殊的胞内抗体Chromobody,结构为纳米抗体与荧光蛋白融合,可以用于监测胞内生化过程。

(4)表达高效、纯化简单。纳米抗体结构简单,适合于原核和各种真核表达系统进行高效表达。重组纳米抗体通常在E. coli中的表达量为5-10 mg/L。在酵母和真菌中产量更高,从1 L振荡培养的酵母菌中培养基能产出100 mg蛋白。纳米抗体研发巨头Ablynx公司(已被赛诺菲收购)利用酵母反应器酿造纳米抗体的产量可达到0.5g/L。不同抗体由于其序列差异表达产量的差异也较大。其特点表现为:A. 当VHH与常规VH相似时,VHH的表达量在酵母中的表达量会下降;B. 当VHH的C端形成二硫键时,VHH的表达量会下降;C. 含有N端糖基化位点的序列,在酵母中的表达量会显著提高。纳米抗体生产价格相对低廉,可大规模生产用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂、亲和纯化基质和科学研究等领域。

纳米抗体可用多种方式进行纯化,并且纯化工艺简单方便。利用酵母培养物上清液纯化的纳米抗体纯度可达到80-90%。细菌提取物通过简单的渗透压冲击,纯化的纳米抗体的纯度能够满足酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白质印迹法的使用标准。利用C末端His6-tag通过Ni-NTA柱提纯,可以获得纯度将近80%的纳米抗体。如果需要进一步纯化,则可以通过离子交换或凝胶过滤层析等方法,可以大大提高纯度。

(5)改造容易。纳米抗体通常是经过基因工程的方法从骆驼血液中克隆出VHH基因,再利用原核或真核细胞进行表达获得。因此,人们容易对现有的纳米抗体进行修饰或对相应的VHH基因进行改造。纳米抗体是理想的多价和多特异性抗体的构建单元,可通过短小的链接序列(linker)聚合在一起转换成多价或多特异的形式。多价抗体比单价抗体具有更高的抗原亲和力,多特异性抗体比单价抗体具有更高的抗原识别能力。此外,由于是单域抗体,能够很容易与其他分子偶联,如连接放射性同位素、连接毒素制备Immunotoxin等;或是通过基因工程技术与其他结构形成新的融合分子,如能延长半衰期的物质酶、抗菌肽或是显影物等

纳米抗体作为一种严格的完整单体,其特殊的结构特征和性质赋予了其一些其它常规抗体或抗体片段所不具有的特性。但是纳米抗体的临床安全性问题,主要包括驼源的Nb在人体内是否会产生免疫应答,以及肾小球滤过导致载体核素或药物诱发肾脏毒性等问题,关系到能否大规模用于肿瘤的诊断与治疗。

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纳米抗体研发现状

当前,首个纳米抗体药物Caplacizumab,由Ablynx(该公司于2018年1月被赛诺菲收购)研发,已于2018年8月31日获欧洲药物管理局(EMA)批准上市,后于2019年2月6日获美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市,商品名为Cablivi®。用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜(aTTP)的成人患者。由于市场上并无该疾病的治疗药物,caplacizumab成为同类第一的药物,2009年获得孤儿药资格。除此,还有多个纳米抗体进入到临床研究阶段。分布在肿瘤、神经系统疾病、感染性疾病、皮肤病、免疫系统疾病等多种疾病领域。但有部分药物已暂停或停止开发(见表格)

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数据来自药渡数据库

相比于传统抗体,纳米抗体克服了开发周期长,稳定性较低,保存条件苛刻等缺陷,逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。